Hiểu rõ các xét nghiệm chẩn đoán sốt rét

Theo Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh sốt rét theo quyết định số 3377/QĐ-BYT của Bộ Y tế ký ngày 30 tháng 8 năm 2023, định nghĩa chẩn đoán bệnh sốt rét bao gồm:

Trường hợp nghi ngờ sốt rét: là những trường hợp có (1) sốt (đang sốt hoặc tiền sử sốt trong 3 ngày gần đây) và (2) yếu tố dịch tễ (đến vùng sốt rét, đang ở hoặc trở về từ vùng sốt rét lưu hành hoặc có tiền sử mắc sốt rét). Tất cả các trường hợp nghi ngờ sốt rét đều phải làm xét nghiệm để phát hiện ký sinh trùng sốt rét. Nếu lần đầu xét nghiệm soi lam âm tính, mà vẫn còn nghi ngờ người đó bị sốt rét, thì phải xét nghiệm lại lam máu sau 8-24 giờ tốt nhất vào thời điểm người bệnh đang lên cơn sốt.

Trường hợp bệnh sốt rét xác định: là trường hợp có KSTSR trong máu được xác định bằng xét nghiệm lam máu nhuộm Giemsa (tiêu chuẩn vàng), hoặc xét nghiệm chẩn đoán nhanh phát hiện kháng nguyên, hoặc kỹ thuật sinh học phân tử.

Sốt rét thể thông thường (chưa biến chứng): là trường hợp mắc sốt rét xác định, không có dấu hiệu đe dọa tính mạng người bệnh, có thể có triệu chứng lâm sàng hoặc không.

Sốt rét ác tính (biến chứng): là trường hợp sốt rét có biến chứng đe dọa tính mạng người bệnh. Sốt rét ác tính thường xảy ra trên những người bệnh nhiễm P. falciparum hoặc nhiễm phối hợp có P. falciparum. Các trường hợp nhiễm các loài KSTSR khác cũng có thể gây sốt rét ác tính.

3.      Xét nghiệm chẩn đoán nhanh phát hiện kháng nguyên (RDTs)

Kể từ năm 2012, TCYTTG khuyến cáo việc lựa chọn RDTs nên dựa vào một số tiêu chuẩn (WHO, 2023a):

-         RDTs chẩn đoán P. falciparum hoặc P. vivax phát hiện được ít nhất 75% trường hợp ở mật độ 200 KSTSR/µL.

-         Tỷ lệ dương tính giả dưới <10%.

-         Tỷ lệ cho kết quả không hợp lệ dưới <5%.

Về cơ chế, các xét nghiệm chẩn đoán nhanh sốt rét hiện nay dựa trên cơ chế phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu (proteins) tổng hợp bởi KSTSR trong máu. Các kháng nguyên này bao gồm protein giàu histidin-2 (HRP2, histidine-rich protein-2), lactate dehydrogenase (LDH) và aldolase (Bell et al., 2006).

PfHRPs. Có ba loại PfHRPs được xác định bao gồm PfHRP1, PfHRP2 và PfHRP3 (Howard et al., 1986; Parra et al., 1991; Rock et al., 1987). PfHRP1 được biểu hiện ở hồng cầu có núm (knobs) do nhiễm P. falciparum, thường kết dính vào các mạch máu nội tạng. PfHRP2 đã được xác định trong tất cả các tế bào hồng cầu nhiễm P. falciparum bất kể hình thái núm, do đó được sử dụng là kháng nguyên đặc hiệu trong các RDTs chẩn đoán P. falciparum. PfHRP3, giống như PfHRP2, có các đoạn axit amin giàu histidine, được tiết ra bởi các P. falciparum và có thể được nhận dạng chéo bởi một số kháng thể đơn dòng phát hiện PfHRP2 trong RDTs. Một vấn đề quan trọng là các đột biến mất gen mã hoá chuỗi axit amin PfHRP2 có thể dẫn đến kết quả âm tính giả từ các RDTs (Mouatcho & Goldring, 2013).

LDH là một enzyme cần thiết để sản xuất năng lượng và là enzyme cuối cùng trong con đường glycolysis của ký sinh trùng. Nó tan trong nước và được sản xuất bởi KSTSR ở cả giai đoạn vô tính và các giao bào (Brown et al., 2004; Hinrichs & Makler, 1993; Houzé et al., 1999). Tất cả các chuỗi pLDH sốt rét chia sẻ các epitope phổ biến (Hurdayal et al., 2010) và do đó các RDTs dựa trên pLDH sử dụng kháng thể chống lại các epitope phổ biến này có thể phát hiện tất cả các loài Plasmodium của con người, bao gồm cả các trường hợp đồng nhiễm (Mayxay et al., 2004). Ngoài ra, có sự khác biệt đủ lớn giữa các chuỗi axit amin LDH của P. falciparum và P. vivax để các RDTs có thể phân biệt giữa hai loài và một bảng các kháng thể có thể phân biệt được tất cả các loài KSTSR nhiễm trên con người, kể cả P. knowlesi (Hurdayal et al., 2010; McCutchan, 2008).

Aldolase là một enzyme glycolytic được tìm thấy trong nhiều mô của vật chủ và trong ký sinh trùng sốt rét, xúc tác quá trình hình thành dihydroxyacetone phosphate và glyceraldehyde-3 phosphate từ fructose 1,6-bisphosphate. Aldolase có ở tất cả các loài KSTSR.  

Đặc điểm các xét nghiệm chẩn đoán nhanh (RDTs) theo kháng nguyên

Đặc điểm	HRP2	pLDH	Aldolase
Phát hiện loài KSTSR	Chỉ P. falciparum	P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae	P. falciparum, P. vivax
Duy trì kết quả dương tính sau khi sạch KST	> 28 ngày	< 10 ngày	< 10 ngày
Biến dị di truyền	Có	Chưa	Chưa
Độ nhạy cho P. falciparum	95%	93,2%	48 – 80%
Độ nhạy cho P. vivax (%) ở mật độ 2000 KSTSR/µL máu	-	78,9 – 98,8%	15 – 83%
Độ đặc hiệu	95,2%	98,5%	*
Đánh giá diễn tiến làm sạch KST	Không	Có	Tiềm năng
Đánh giá hiệu lực thuốc	Không	Có	Tiềm năng
Hiệu ứng prozone	Có	Không	Không
Giá trị dự báo SRAT	Tiềm năng	*	*
Chẩn đoán SRAT	Tiềm năng	*	*
* Chưa có dữ liệu

2.      Xét nghiệm lam máu dưới kính hiển vi

Xét nghiệm lam máu giọt dày và giọt mỏng nhuộm giemsa và soi dưới kính hiển vi được xem là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán sốt rét. Tuy nhiên, độ nhạy và đặc hiệu của xét nghiệm này phụ thuộc nhiều vào quy trình xét nghiệm và trình độ, kinh nghiệm của kỹ thuật viên. Mục tiêu của xét nghiệm lam máu dưới kính hiển vi bao gồm: phát hiện KSTSR, định danh loài KSTSR, và đếm mật độ KSTSR

Phát hiện KSTSR. Việc soi lam phát hiện KSTSR thông thường được thực hiện ở giọt dày. Một kỹ thuật viên soi lam kinh nghiệm có thể phát hiện ở độ nhạy khoảng 5-10 KSTSR/µL máu. Có thể kết luận lam máu là âm tính với KSTSR sau khi soi đủ một số lượng bạch cầu hoặc số lượng vi trường nhất định. Thông thường trên lâm sàng sử dụng ngưỡng 1000 bạch cầu hoặc 100 vi trường, với mỗi vi trường tốt có khoảng 15-20 bạch cầu (WHO, 2010). Trong điều kiện nghiên cứu, có thể cân nhắc sử dụng mốc 2500 bạch cầu hoặc 200 vi trường, với mỗi vi trường tốt có khoảng 10-15 bạch cầu (WHO, 2015).

Định loài KSTSR. Việc xác định loài KSTSR có thể dựa vào một số đặc điểm của hồng cầu nhiễm, đặc điểm của nhân và nguyên sinh chất của KSTSR, và các hạt (Schuffner, Maurer) trong tế bào hồng cầu. 

    Đếm mật độ KSTSR. Ở Việt Nam, việc đếm mật độ KSTSR thường được thực hiện trên giọt dày, tuy nhiên việc này cũng có thể được thực hiện trên lam máu giọt mỏng. Mỗi phương pháp đều có những điểm mạnh và hạn chế riêng, do đó tuỳ vào quy định của từng chương trình hoặc nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp đếm cho phù hợp. Thông thường, mật độ KSTSR đếm trên giọt dày được thực hiện khi mật độ <~16.000 KSTSR/μLvà mật độ KSTSR đếm trên giọt mỏng được thực hiện khi mật độ >~ 16.000 KSTSR/μL. Có thể ước lượng bằng cách (WHO, 2015):

-     Đếm số lượng KSTSR và bạch cầu trên 10 vi trường giọt dày;

-     Nếu số lượng KSTSR thể vô tính > 2 lần số bạch cầu, đếm mật độ KSTSR trên giọt mỏng;

-     Nếu số lượng KSTSR thể vô tính ≤ 2 lần số bạch cầu, đếm mật độ KSTSR trên giọt dày.

Giọt dày. Mật độ KSTSR đếm trên giọt dày được tính toán dựa trên một số lượng bạch cầu nhất định. Chính xác nhất là khi bệnh nhân được xét nghiệm công thức máu để biết số lượng bạch cầu. Tuy nhiên, có thể sử dụng con số trung bình 8000 bạch cầu (được xem là khá chính xác) để tính toán mật độ KSTSR theo công thức:

Một số lưu ý (WHO, 2010):

-     Khi đếm được đến 200 bạch cầu, nếu số lượng KSTSR ≥ 100 thì ngưng đếm, ghi nhận số liệu và tính toán mật độ KSTSR. Nếu số lượng KSTSR đếm được ≤ 99, tiếp tục đếm đến 500 bạch cầu.

-     Nếu mật độ KSTSR quá cao lên đến hàng trăm KSTSR trên một vi trường, có thể đếm đến 100 bạch cầu, hoặc khoảng 5 vi trường.

-     Trong trường hợp đồng nhiễm nhiều loài KSTSR, thông thường các thể vô tính được đếm và ghi nhận kết quả chung với nhau. Ví dụ: P. falciparum + P. vivax = X μL.

Ngoài ra, có thể ghi nhận mật độ KSTSR một cách bán định lượng. Đây là phương pháp cũ và ít được sử dụng hiện nay vì có độ chính xác thấp hơn:

-     + = 1 – 10 KSTSR/100 vi trường

-     ++ = 11 – 100 KSTSR/ 100 vi trường

-     +++ = 1 – 10 KSTSR/ 1 vi trường

-     ++++ = > 10 KSTSR/ 1 vi trường

Giọt mỏng. Mật đọ KSTSR đếm trên giọt mỏng được được ghi nhận bằng số hồng cầu nhiễm KSTSR trên tổng số khoảng 2000 (>1900) hồng cầu đếm được. Nếu sau khi đếm 2000 hồng cầu không phát hiện hồng cầu nhiễm, chuyển sang lam máu giọt đặc để soi phát hiện KSTSR như mô tả phía trên.

3.  Xét nghiệm sinh học phân tử

Với lợi điểm có độ đặc hiệu và độ nhạy cao (< 10 KSTSR/μL), các xét nghiệm khuếch đại acid nucleic (NAATs) hiện nay đang được áp dụng trong việc phát hiện, định loài, và định lượng KSTSR; cũng như ứng dụng trong việc phát hiện các chỉ điểm phân tử liên quan đến kháng thuốc. Tuy nhiên, các xét nghiệm này chưa thay thế được các phương pháp xét nghiệm RDTs và xét nghiệm kính hiển vi bởi vì yêu cầu cao đối với vật tư trang thiết bị, kỹ thuật, và chưa có chuẩn hoá các quy trình (van Bergen et al., 2021).

Nguyên tắc: Đoạn gene 18S rRNA thường được sử dụng làm DNA đích để phát hiện các loài Plasmodium bằng xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase (PCR) (Tham et al., 1999). Đoạn gene này được chọn bởi vì nó vừa có tính ổn định (để phát hiện KSTSR), vừa có tính biến thiên (để định loài KSTSR) (McCutchan et al., 1995). Theo đó, các đoạn gene mồi (primers) có thể chia làm hai loại: (1) primers đặc hiệu giống Plasmodium và (2) primers đặc hiệu loài. Mỗi phòng xét nghiệm khác nhau có thể sử dụng các đoạn mồi khác nhau và kỹ thuật phân tử khác nhau (tham khảo một số đoạn mồi ở Bảng 4):

-     PCR truyền thống (conventional PCR): khuếch đại và phát hiện đoạn DNA.

-     PCR sao chép ngược (RT-PCR, reverse transcriptase PCR): sử dụng enzyme phiên giải ngược để chuyển mRNA thành DNA trước khi thực hiện PCR; do đó phát hiện RNA.

-     PCR thời gian thực (qPCR, realtime PCR): cho phép theo dõi quá trình phản ứng chuỗi DNA theo thời gian thực (từng vòng phản ứng).

-     PCR lồng ghép (nested PCR): hai phản ứng chuỗi khác nhau được thực hiện liên tiếp trên cùng một mẫu DNA với cặp mồi khác nhau cho từng phản ứng.

-     PCR đa mồi (multiplex PCR): cho phép khuếch đại nhiều trình tự DNA chỉ trong một phản ứng PCR.

Các đoạn mồi và đoạn dò sử dụng xác định loài Plasmodium trên gene 18S rRNA (Lazrek et al., 2023)

Loài KSTSR	Tênđoạn mồi hoặc đoạn dò	Trình tự đoạn mồi 5′–3′	Fluorescent
P. falciparum	Fal-F	CCGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGTTAA	VIC-MGBNFQ
	Fal-R	AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
	Fal probe	AGCAATCTAAAAGTCACCTCGAAAGATGACT
P. vivax	Viv-F	CCGACTAGGCTTTGGATGAAAGATTTTA	NED-MGBNFQ
	Viv-R	AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
	Viv probe	AGCAATCTAAGAATAAACTCCGAAGAGAAAATT
P. malariae	Mal-F	CCGACTAGGTGTTGGATGATAGAGTAAA	FAM-MGBNFQ
	Mal-R	AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
	Mal probe	CTATCTAAAAGAAACACTCAT
P. ovale	Ova-F	CCGACTAGGTTTTGGATGAAAGATTTTT	VIC-MGBNFQ
	Ova-R	AACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAA
	Ova probe	CGAAAGGAATTTTCTTATT
P. knowlesi	Knw-F	CTAAAATGCGCACAAAGTCGAT	NED-MGBNFQ
	Knw-R	GCAGTTAAAACGCTCGTAGTTGAA
	Knw probe-1	CGGAGGCATCAGTTAT
Plasmodiumspp.	Spp-F	AGCTCTTTCTTGATTTCTTGG	VIC-MGBNFQ
	Spp-R	CAGACAAATCATATTCACGAACT
	Spp probe-1	AAACGGCCATGCATCACCAT
Human β2-megaglobulin	2βMG-F	TGAGTATGCCTGCCGTGTGA	FAM-MGBNFQ
	2βMG-R	ACTCATACACAACTTTCAGCAGCTTAC
	2βMG probe	CCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTT

Tổng hợp: ThS.BS. Châu Văn Khánh