Xét nghiệm sinh học phân tử bằng kỹ thuật nested-PCR (PCR lồng) xác định loài KSTSR

Mẫu máu chích đầu ngón tay hoặc máu tĩnh mạch sẽ được thu thập vào mẫu giấy thấm Whatmann 31 ET chromatography, bảo quản riêng biệt vào trong túi nilon có khoá và có hút ẩm. Đoạn gene 18S rRNA được sử dụng làm DNA đích để phát hiện các loài Plasmodium bằng xét nghiệm phản ứng chuỗi polymerase như đã được mô tả trước đây [1].

Nguyên lý: Sử dụng kỹ thuật PCR lồng (Nested-PCR) để phân biệt các loài KSTSR trong máu bệnh nhân, bao gồm phản ứng outer PCR nhằm khuếch đại một đoạn gen có kích thước khoảng 1,2kb đặc trưng cho KSTSR nói chung và phản ứng nested PCR nhằm khuếch đại đoạn gen đặc trưng cho từng loài KSRSR gây bệnh ở người.

PCR xác định loài KSTSR:

-     Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu: PLU5-PLU6; FF-FR; VF-VR; MF-MR; OF-OR để xác định KSTSR [2].

-     Phản ứng khuếch đại Nested PCR được thực hiện qua 2 giai đoạn: Outer PCR và Nested PCR.

Sơ đồ phản ứng nested PCR gen 18S để xác định 4 loài KSTSR

+ Outer PCR: Sử dụng cặp mồi PLU5 và PLU6 để khuyếch đại đoạn DNA đặc hiệu của Plasmodiumcó kích thước ~1200bp. Phản ứng thực hiện trong tube Eppendorf 0,2ml.

Thành phần phản ứng: 

10X     Buffer	5 µl
25mM MgCl2	3 µl
10mM dNTP	1 µl
10µM Plu5	2 µl
10µM Plu6	2 µl
Taq DNA polymerase (5U/ µl)	0,2 µl
Nước tinh khiết	31,8 µl
DNA khuôn	5 µl
Tổng số	50 µl

Chu trình nhiệt:

Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
95oC	5 phút	1 chu kỳ
94oC	45 giây	35 chu kỳ
55oC	1 phút
72oC	1 phút 30 giây
72oC	10 phút
Bảo quản sản phẩm PCR ở 4oC

10X Buffer	5 µl
25mM MgCl2	3 µl
10mM dNTP	1 µl
10µM Mồi xuôi	2 µl
10µM Mồi ngược	2 µl
Taq DNA polymerase (5U/ µl)	0,2 µl
Nước tinh khiết	31,8 µl
DNA khuôn	5 µl
Tổng số	50 µl

+ Nested PCR: Sản phẩm Outer PCR được dùng để khuếch đại bằng các cặp mồi FF- FR; VF-VR; MF-MR và OF-OR để xác định 4 loại ký sinh trùng tương ứng là P.falciparum, P.vivax, P.malariae, P.ovale. 

Thành phần phản ứng: 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Chu trình nhiệt:

Nhiệt độ	Thời gian	Chu kỳ
95oC	5 phút	1 chu kỳ
94oC	45 giây	35 chu kỳ
58oC	1 phút
72oC	1 phút 30 giây
72oC	10 phút

-     Đọc kết quả: Sản phẩm PCR được điện di trên thạch agarose 1.8%, nhuộm bằng Ethidium Bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy đọc UV, ghi hình vào máy tính.

Tài liệu tham khảo

[1] Tham JM, Lee SH, Tan TM, Ting RC, Kara UA. Detection and species determination of malaria parasites by PCR: comparison with microscopy and with ParaSight-F and ICT malaria Pf tests in a clinical environment. J Clin Microbiol. 1999 May;37(5):1269-73. doi: 10.1128/JCM.37.5.1269-1273.1999. Erratum in: J Clin Microbiol 1999 Nov;37(11):3788. PMID: 10203469; PMCID: PMC84748.

[2] Snounou G, Viriyakosol S, Zhu XP, Jarra W, Pinheiro L, do Rosario VE, Thaithong S, Brown KN. High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction. Mol Biochem Parasitol. 1993 Oct;61(2):315-20. doi: 10.1016/0166-6851(93)90077-b. PMID: 8264734.